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RT－PCR 已經(jīng)成為研究者確定感興趣的器官、組織或細(xì)胞中mRNA 轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的基本方法。RT－PCR的基本步驟包括：首先對樣品中出現(xiàn)的所有mRNA 合成一個cDNA拷貝，接著擴(kuò)增感興趣的基因。因為兩個步驟中使用的反應(yīng)緩沖液不能兼容，所以這兩個步驟（RT 和PCR）通常分別進(jìn)行。即使有些試劑盒能將兩個步驟合而為一，但是同樣因為上述的緩沖液不兼容性，地限制了檢測靈敏度。Eppendorf 設(shè)計了一個含有全新化學(xué)物質(zhì)的新試劑盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在兩步法實驗中可以獲得更高的靈敏度。

簡介

    逆轉(zhuǎn)錄（RT）以及隨后進(jìn)行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術(shù)之一。如果需要平行分析多個RNA 樣品，方法為一步法RT－PCR。如果要擴(kuò)增困難目標(biāo)片段或從單一cDNA 池中擴(kuò)增多重目標(biāo)片段則會選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)適用于各種RT－PCR 應(yīng)用。它含有一種全新的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應(yīng)緩沖液能夠自動調(diào)節(jié)鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無需優(yōu)化。這種自我調(diào)節(jié)的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實現(xiàn)的。如果鎂離子濃度過高，螯合劑會與過剩的鎂離子結(jié)合，如果反應(yīng)（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會被釋放出來。這種創(chuàng)新技術(shù)提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進(jìn)行一步法，又能進(jìn)行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動力學(xué)檢測范圍，能擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長度范圍也很大（一步法反應(yīng)zui長可擴(kuò)增5.3 kb片段；兩步法方案zui長能擴(kuò)增12.3 kb 片段）。

下面的實驗可以展示該試劑盒在不同應(yīng)用中的表現(xiàn)。
    實驗1關(guān)注新試劑盒在一步法RT－PCR 中的靈敏度。而在一步法應(yīng)用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標(biāo)材料進(jìn)行有效工作。

    實驗2顯示應(yīng)用一步法方案進(jìn)行長距離RT－PCR 不再是個難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時保證逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。

    本系統(tǒng)提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實驗3描述了對不同模板的擴(kuò)增情況。這個新的系統(tǒng)能為所有的RT目標(biāo)提供全面解決方案，不論需要擴(kuò)增的片段是中等長度還是極長，不同來源的總RNA 中轉(zhuǎn)錄本是低豐度還是高豐度。

材料和方法

Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進(jìn)行。

實驗1：一步法靈敏度檢測RT－PCR 
擴(kuò)增目標(biāo)：500 bp 的人α微管蛋白mRNA。
模板RNA：從人HELA細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應(yīng)總體積50μl
 循環(huán)參數(shù)：

結(jié)果

cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

實驗2：一步法擴(kuò)增長片段RT－PCR 

擴(kuò)增目標(biāo)：5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA&片段。
模板RNA：從人HELA 細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度為100ng和10ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。

設(shè)置一步法RT－PCR 反應(yīng)。

 循環(huán)程序參數(shù)

結(jié)果

如圖2 所示，應(yīng)用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產(chǎn)物。這個PCR 反應(yīng)非常困難，大多數(shù)RT－PCR 試劑盒生物試劑廠家從未發(fā)布過應(yīng)用一步法方案，有效擴(kuò)增類似長度模板的結(jié)果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩(wěn)定可靠地從10 ng HELA 細(xì)胞RNA 中擴(kuò)增該產(chǎn)物。

實驗3：兩步法RT－PCR 

兩步法RT－PCR 的擴(kuò)增目標(biāo)：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA pian段
1.3kb 的（鼠和人）腫瘤壞死因子受體（TNFR1）mRNA pian段
5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA pian段
12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA pian段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產(chǎn)品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物為引物。

設(shè)置*步RT 反應(yīng)

設(shè)置第二步PCR 反應(yīng)

RT反應(yīng)條件

注：動力蛋白的逆轉(zhuǎn)錄孵育時間延長至90 分鐘。

* —— 微管蛋白
** —— TNFR1

hTSF 和動力蛋白的三步循環(huán)方案

不同大小目的片段所采用的延伸時間和退火溫度

 結(jié)果

對5 種不同表達(dá)水平的基因進(jìn)行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應(yīng)分開進(jìn)行。如圖3 所示，對于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應(yīng)用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進(jìn)行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無論片段長度大小和拷貝數(shù)高低，所有反應(yīng)都可以順利進(jìn)行。即使對于動力蛋白這種特別長（達(dá)12.3 kb）的稀有轉(zhuǎn)錄本，用cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)也能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增，而且結(jié)果具有的重復(fù)性，表明即使對于困難的RT－PCR 反應(yīng)， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結(jié)果。

  cMaster RT 系統(tǒng)是為了給所有的RT 和RT－PCR 應(yīng)用提供zui大的靈活性而設(shè)計的。該試劑盒結(jié)合了重組的同二聚體病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和*的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)，可以在較寬的溫度范圍（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb產(chǎn)物大小范圍內(nèi)進(jìn)行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應(yīng)用于一步法中，可以靈敏地檢測到極少量的總RNA 并擴(kuò)增出長達(dá)5.3 kb的cDNA（參見圖1 和圖2） 兩步法方案可以從RT 反應(yīng)中擴(kuò)增多個目的cDNA，PCR產(chǎn)物的片段長度可增加至12.3 kb（參見圖3） 其他的擴(kuò)展應(yīng)用：系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統(tǒng)合用或者為其他下游應(yīng)用如雜交實驗合成cDNA 探針。