microRNA（miRNA）分子雖小，卻在基因表達的調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。為了更好地了解miRNA影響健康和疾病的機制，我們首先需要知道m(xù)iRNA會對哪些基因起作用。然而，這并非易事。每個miRNA都能夠調(diào)控數(shù)以百計的靶基因。之前的miRNA靶標預測主要是通過一些算法來實現(xiàn)，而Clontech公司（Takara旗下）近日推出一種新工具，能協(xié)助鑒定細胞中的miRNA靶標。
這一工具名為MirTrap系統(tǒng)。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體，允許miRNA與其靶標結合，但限制進一步的加工。此亞基整合到內(nèi)源的Argonaute/RISC復合物中，并“鎖定”miRNA-靶標mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK（FLAG表位）標簽允許整個Ago/RISC復合物的捕獲和分離。這樣就能實現(xiàn)miRNA及其靶標的免疫沉淀，從而通過新一代測序或定量PCR來鑒定或定量。
整個過程大致如下：
1. 創(chuàng)建miRNA模擬物。
2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉染到哺乳動物細胞，并孵育24小時。同時利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對照載體開展對照轉染。
3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉染后的細胞培養(yǎng)物。
4. 利用分離試劑盒中的磁珠對RISC復合物（其中包括靶標mRNA）進行免疫沉淀。
5. 利用附帶的NucleoSpin RNA XS試劑盒分離與磁珠結合的靶標mRNA。
6. 通過qPCR或新一代測序分析分離出的RNA，鑒定出特定miRNA的靶標mRNA。
MirTrap系統(tǒng)中包含了pMirTrap載體、免疫沉淀及后續(xù)分離所需的試劑、Xfect microRNA轉染試劑以及對照試劑，足夠15次分析使用。
Xfect microRNA轉染試劑也是Clontech推出的產(chǎn)品。它形成可生物降解的納米顆粒，從而實現(xiàn)miRNA的轉染。此試劑盒提供兩種轉染聚合物：Xfect MicroRNA Transfection Polymer，這是為小RNA的轉染而優(yōu)化的；Xfect Polymer，這是為質粒DNA而優(yōu)化的。
在miRNA轉染時，只需要Xfect MicroRNA Transfection Polymer；而在miRNA與質粒DNA的共轉染時，須在轉染反應中加入少量的Xfect Polymer。轉染過程可在血清存在時開展。
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