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南京信帆生物:非同位素原位雜交組化與免疫組化聯(lián)合法實驗步驟
更新時間:2016-04-26   點擊次數(shù):1070次

步驟如下:

  (1)將切片漂浮于能經(jīng)受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2沖洗3×5min。
  (2)0.1mol/L苷氨酸PBS沖洗5min。
  (3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。
  (4)1μg./ml蛋白酶k(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配),37℃保溫30min。
  (5)4%多聚甲醛PBs 5min。
  (6)PBS沖洗2×min。
  (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配)10min。
  (8)2×SSC沖洗10min。
  (9)將切片用滅菌吸水紙吸干,然后入雜交液。核酸探針濃度為0.25~0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12~16h。
  (10)4×SSc 37℃沖洗30min。
  (11)2×SSC(含RNAsea 20μg/ml)37℃保溫30min。
  (12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分別沖洗30min。
  (13)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
  (14)0.5%H2O2 PBS室溫20min。
  (15)0.05mol/l PBS 沖洗2×5min。
  (16)堿性酶標記抗體(Fab)與抗蛋白或多肽等抗體混合液,前者一般1:1000稀釋,后者則因抗體而異。稀釋液:1%BSA,0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2,4℃孵育24h。
  (17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
  (18)二抗(1:100~1:200)37℃保溫1h。
  (19)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
  (20)PAP(1:200~1:400)37℃保溫1h。
  (21)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
  (22)DAB顯色液(0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配)顯色5~10min。
  (23)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
  (24)TSM,沖洗2×5min(TSM1:0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2).
  (25)硝基四氮唑藍(400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚(200μg/ml)混合液(TSM2配顯色混合液)顯色1~3h,避光。
  (26)20mmol/l EDTA終止顯色。
  (27)將切片貼于涂有鉻礬明膠的載片上,空氣干燥。
  (28)梯度酒精脫水,透明、封片。

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